【生物信息学】基因差异分析Deg（数据读取、数据处理、差异分析、结果可视化）

2024-07-30 08:37:35 浏览数 (1)

一、实验介绍

本实验完成了基因差异分析，包括数据读取、数据处理（ 绘制箱型图、删除表达量低于阈值的基因、计算差异显著的基因）、差异分析（进行秩和检验和差异倍数计算）等，成功识别出在正常样本与肿瘤样本之间显著表达差异的基因，并对其进行了进一步的可视化分析（箱型图、差异倍数fold分布图、热力图和散点图）。

基因差异分析是研究不同条件下基因表达差异的重要手段，能够帮助我们理解生物体内基因调控的变化及其与表型特征的关联。本实验旨在探索正常样本与肿瘤样本之间基因表达的差异，并识别差异显著的基因。

二、实验环境

本系列实验使用了PyTorch深度学习框架，相关操作如下（基于深度学习系列文章的环境）：

1. 配置虚拟环境

深度学习系列文章的环境

代码语言：javascript复制
conda create -n DL python=3.7
代码语言：javascript复制
conda activate DL
代码语言：javascript复制
pip install torch==1.8.1 cu102 torchvision==0.9.1 cu102 torchaudio==0.8.1 -f https://download.pytorch.org/whl/torch_stable.html
代码语言：javascript复制
conda install matplotlib
代码语言：javascript复制
conda install scikit-learn

新增加

代码语言：javascript复制
conda install pandas
代码语言：javascript复制
conda install seaborn
代码语言：javascript复制
conda install networkx
代码语言：javascript复制
conda install statsmodels
代码语言：javascript复制
pip install pyHSICLasso

注：本人的实验环境按照上述顺序安装各种库，若想尝试一起安装（天知道会不会出问题）

2. 库版本介绍

软件包

本实验版本

目前最新版

matplotlib

3.5.3

3.8.0

numpy

1.21.6

1.26.0

python

3.7.16

scikit-learn

0.22.1

1.3.0

torch

1.8.1 cu102

2.0.1

torchaudio

0.8.1

2.0.2

torchvision

0.9.1 cu102

0.15.2

新增

networkx

2.6.3

3.1

pandas

1.2.3

2.1.1

pyHSICLasso

1.4.2

1.4.2

seaborn

0.12.2

0.13.0

statsmodels

0.13.5

0.14.0

3. IDE

建议使用Pycharm（其中，pyHSICLasso库在VScode出错，尚未找到解决办法……）

win11 安装 Anaconda（2022.10） pycharm（2022.3/2023.1.4） 配置虚拟环境_QomolangmaH的博客-CSDN博客

https://blog.csdn.net/m0_63834988/article/details/128693741

三、实验内容

0. 导入必要的工具包

代码语言：javascript复制
import numpy as np
import pandas as pd
import scipy
import matplotlib.pyplot as plt
import seaborn as sns
from scipy.stats import zscore
from scipy.stats import ranksums
from pyHSICLasso import HSICLasso
from sklearn.preprocessing import LabelEncoder

1. 定义一些阈值和参数

代码语言：javascript复制
p_cutoff = 0.001
FC_cutoff = 3
num_cutoff = 10
  • p_cutoff 是判断差异显著性的 p 值阈值。
  • FC_cutoff 是判断差异的倍数阈值。
  • num_cutoff 是基因表达量筛选的阈值。

2. 读取数据

代码语言：javascript复制
ndata = pd.read_csv("normal_data.csv", index_col=0, header=0)
tdata = pd.read_csv("tumor_data.csv", index_col=0, header=0)

从文件 "normal_data.csv" 和 "tumor_data.csv" 中读取正常样本和肿瘤样本的基因表达数据。

normal_data.csv部分展示

TCGA-BL-A13J-11A-13R-A10U-07

TCGA-BT-A20N-11A-11R-A14Y-07

TCGA-BT-A20Q-11A-11R-A14Y-07

TCGA-BT-A20R-11A-11R-A16R-07

TCGA-BT-A20U-11A-11R-A14Y-07

TCGA-BT-A20W-11A-11R-A14Y-07

TCGA-BT-A2LA-11A-11R-A18C-07

TCGA-BT-A2LB-11A-11R-A18C-07

TCGA-CU-A0YN-11A-11R-A10U-07

TCGA-CU-A0YR-11A-13R-A10U-07

TCGA-GC-A3BM-11A-11R-A22U-07

TCGA-GC-A3WC-11A-11R-A22U-07

TCGA-GC-A6I3-11A-11R-A31N-07

TCGA-GD-A2C5-11A-11R-A180-07

TCGA-GD-A3OP-11A-11R-A220-07

TCGA-GD-A3OQ-11A-21R-A220-07

TCGA-K4-A3WV-11A-21R-A22U-07

TCGA-K4-A54R-11A-11R-A26T-07

TCGA-K4-A5RI-11A-11R-A28M-07

?1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

?2

2.5521

3.8933

5.4594

16.4583

34.4264

5.2219

11.346

38.256

4.3054

8.7471

21.0084

3.1837

0

6.0128

17.7621

40.8452

8.3088

13.7216

1.5099

?3

8.5119

5.7305

10.4417

7.681

19.062

1.3534

3.4219

25.7514

1.4834

6.5471

9.6515

2.6472

5.3121

10.7337

19.364

19.138

19.5273

18.5364

14.4093

?4

117.4995

103.9108

148.8251

100.9537

162.7054

128.9808

118.3924

124.8423

180.5137

131.3118

127.6985

145.6327

95.2855

119.1427

149.7972

128.4473

142.8571

128.644

139.1199

?5

619.5833

738.4077

679.3286

786.7036

1132.558

1032.877

1158.65

1143.321

687.4096

690.5882

697.5129

697.3761

1551.793

556.2201

1018.907

646.4851

895.4832

903.8232

836.9674

?6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

?7

128.3422

115.4856

119.258

120.6965

120.9302

54.7945

82.7004

91.3729

66.5702

153.5294

259.3317

272.8863

291.5007

94.4976

250.6016

253.2622

313.5504

270.6093

187.172

?8

0.7376

0

0

0.3957

0.7752

0.5479

0

0.4638

0

0

0

0

0

0

0

0.3332

0

0

0

?9

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0.3987

0

0

0

0

0

tumor_data.csv部分展示

TCGA-BT-A42F-01A-11R-A23W-07

TCGA-C4-A0EZ-01A-21R-A24X-07

TCGA-C4-A0F0-01A-12R-A10U-07

TCGA-C4-A0F1-01A-11R-A034-07

TCGA-C4-A0F6-01A-11R-A10U-07

TCGA-C4-A0F7-01A-11R-A084-07

TCGA-CF-A1HR-01A-11R-A13Y-07

TCGA-CF-A1HS-01A-11R-A13Y-07

TCGA-CF-A27C-01A-11R-A16R-07

TCGA-CF-A3MF-01A-12R-A21D-07

TCGA-CF-A3MG-01A-11R-A20F-07

TCGA-CF-A3MH-01A-11R-A20F-07

TCGA-CF-A3MI-01A-11R-A20F-07

TCGA-CF-A47S-01A-11R-A23W-07

TCGA-CF-A47T-01A-11R-A23W-07

TCGA-CF-A47V-01A-11R-A23W-07

TCGA-CF-A47W-01A-11R-A23W-07

TCGA-CF-A47X-01A-31R-A23W-07

TCGA-CF-A47Y-01A-11R-A23W-07

TCGA-CF-A5U8-01A-11R-A28M-07

?1

0

0.3671

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

2.1101

0

0

0

0

0

0.5737

0

?2

3.7613

7.3281

0

5.3598

2.8093

6.4777

13.9372

3.5684

40.3762

9.0914

9.0853

4.7409

3.974

2.3904

7.0211

11.2489

0

19.5722

6.3454

6.4641

?3

2.8959

5.5218

0.6636

0

4.545

2.8922

6.8144

5.3975

41.0665

3.6238

6.0806

12.1334

8.6865

7.8033

5.6677

17.3953

5.1887

17.4112

18.3247

13.092

?4

117.7889

443.1501

144.1446

92.6276

136.3486

238.557

91.604

211.2791

100.4809

27.5497

101.9194

105.918

78.537

120.6983

212.0846

70.1299

106.1415

150.7324

103.2415

149.5243

?5

1754.636

1546.397

4391.827

868.8195

685.4201

1752.167

1229.95

1456.665

966.0655

1691.126

1220.853

1279.229

2167.048

1399.592

1939.577

978.7596

1754.717

1110.225

1262.765

1477.273

?6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

?7

192.1065

306.1955

15.9268

66.9972

157.3819

32.1699

73.4717

49.6115

426.9924

745.9603

48.8152

402.5713

229.9982

266.8196

120.8459

472.8729

135.8491

640.3191

553.0694

511.0994

?8

0

2.9371

0

0

0.7354

0

0

0.5977

1.1635

1.0596

0

0.8035

0

0.5097

0.6042

0.4855

0

1.4503

4.5898

0.5285

?9

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

3. 绘制箱型图

代码语言：javascript复制
ndata.iloc[1000:1010, ].transpose().plot(kind='box', title='Normal Sample Gene Boxplot', rot=30)
plt.tick_params(labelsize=10)
plt.savefig('Normal_Sample_Gene_box_plot', bbox_inches='tight')
plt.show()

绘制正常样本中部分基因的箱型图，并保存为图片文件。

4. 删除表达量低于阈值的基因

代码语言：javascript复制
ndata = ndata.iloc[29:, :]
tdata = tdata.iloc[29:, :]

删除正常样本和肿瘤样本中表达量低于阈值的基因。

5. 计算差异显著的基因

代码语言：javascript复制
gene_sig = ndata[ndata.mean(axis=1) > num_cutoff].index.intersection(tdata[tdata.mean(axis=1) > num_cutoff].index)
Ndata = ndata.loc[gene_sig]
Tdata = tdata.loc[gene_sig]

选择正常样本和肿瘤样本中表达量高于阈值的基因，并保存为新的数据。

6. 初始化结果数据表格

代码语言：javascript复制
p_value = [1.] * len(Ndata)
log2FoldChange = []
label = ['0'] * len(Ndata)
result = pd.DataFrame([p_value, log2FoldChange, label])
result = result.transpose()
result.columns = ['p_value', 'log2FC', 'label']
result.index = Ndata.index.tolist()
p = []

创建一个结果数据表格，包含 p 值、log2 fold change 和标签，并初始化为默认值。

7. 进行秩和检验和差异倍数计算

代码语言：javascript复制
for i in Ndata.index:
    p1 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i], alternative='greater')[1]
    p2 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i], alternative='less')[1]
    p3 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i])[1]
    result.loc[i, 'log2FC'] = np.log2(np.average(Tdata.loc[i]) / np.average(Ndata.loc[i]))
    p.append(p3)
    if (p1 <= p_cutoff):
       result.loc[i, 'p_value'] = p1
       if result.loc[i, 'log2FC'] > np.log2(FC_cutoff):
           result.loc[i, 'label'] = '1'

    if (p2 <= p_cutoff):
       result.loc[i, 'p_value'] = p2
       if result.loc[i, 'log2FC'] < -np.log2(FC_cutoff):
           result.loc[i, 'label'] = '-1'

对每个基因进行秩和检验，计算 p 值和差异倍数，并根据设定的阈值确定差异显著的基因，并给予标签。

8. 可视化分析

代码语言：javascript复制
print('finished')
plt.hist(result['log2FC'], bins=10, color='blue', alpha=0.6, edgecolor='black')
plt.title("fold change")
plt.show()

9. 代码整合

代码语言：javascript复制
import numpy as np
import pandas as pd
import scipy
import matplotlib.pyplot as plt
import seaborn as sns
from scipy.stats import zscore
from scipy.stats import ranksums
from pyHSICLasso import HSICLasso
from sklearn.preprocessing import LabelEncoder


p_cutoff = 0.001
FC_cutoff = 3
num_cutoff = 10

# 读取数据ndata normal data,tdata tumor data
ndata = pd.read_csv("normal_data.csv", index_col=0, header=0)
tdata = pd.read_csv("tumor_data.csv", index_col=0, header=0)

# 箱型图
# 中位数
# QL称为下四分位数，表示全部观察值中有四分之一的数据取值比它小；
# QU称为上四分位数，表示全部观察值中有四分之一的数据取值比它大；
# IQR称为四分位数间距，是上四分位数QU与下四分位数QL之差，其间包含了全部观察值的一半。
# 异常值通常被定义为小于QL－1.5IQR或大于QU＋1.5IQR的值。
ndata.iloc[1000:1010, ].transpose().plot(kind='box', title='Normal Sample Gene Boxplot', rot=30)
plt.tick_params(labelsize=10)
plt.savefig('Normal_Sample_Gene_box_plot', bbox_inches='tight')
plt.show()

# delete gene expression < num
ndata = ndata.iloc[29:, :]
tdata = tdata.iloc[29:, :]
gene_sig = ndata[ndata.mean(axis=1) > num_cutoff].index.intersection(tdata[tdata.mean(axis=1) > num_cutoff].index)
Ndata = ndata.loc[gene_sig]
Tdata = tdata.loc[gene_sig]
p_value = [1.] * len(Ndata)
# log2 fold change的意思是取log2，这样可以可以让差异特别大的和差异比较小的数值缩小之间的差距
log2FoldChange = []
label = ['0'] * len(Ndata)

result = pd.DataFrame([p_value, log2FoldChange, label])
result = result.transpose()
result.columns = ['p_value', 'log2FC', 'label']
result.index = Ndata.index.tolist()
p = []

# 秩和检验(也叫Mann-Whitney U-test)，检验两组数据是否来自具有相同中位数的连续分布，检验它们是否有显著差异。
# ’less‘ 基于 x 的分布小于基于 y 的分布
# ‘greater’ x 的分布大于 y 的分布。

for i in Ndata.index:
    p1 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i], alternative='greater')[1]
    p2 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i], alternative='less')[1]
    p3 = ranksums(Tdata.loc[i], Ndata.loc[i])[1]
    result.loc[i, 'log2FC'] = np.log2(np.average(Tdata.loc[i]) / np.average(Ndata.loc[i]))
    p.append(p3)
    if (p1 <= p_cutoff):
       result.loc[i, 'p_value'] = p1
       if result.loc[i, 'log2FC'] > np.log2(FC_cutoff):
           result.loc[i, 'label'] = '1'

    if (p2 <= p_cutoff):
       result.loc[i, 'p_value'] = p2
       if result.loc[i, 'log2FC'] < -np.log2(FC_cutoff):
           result.loc[i, 'label'] = '-1'

print('finished')
# 查看差异倍数fold分布
plt.hist(result['log2FC'], bins=10, color='blue', alpha=0.6, edgecolor='black')
plt.title("fold change")
plt.show()


# result.to_csv('result.csv')
up_data_n = Ndata.loc[result.query("(label == '1')").index]
up_data_t = Tdata.loc[result.query("(label == '1')").index]
down_data_n = Ndata.loc[result.query("(label == '-1')").index]
down_data_t = Tdata.loc[result.query("(label == '-1')").index]
data = pd.concat([pd.concat([up_data_n, up_data_t], axis=1), pd.concat([down_data_n, down_data_t], axis=1)], axis=0)
deg_gene = pd.DataFrame(data.index.tolist())
deg_gene.to_csv('deg_gene.csv')
z1 = zscore(np.log2(data 1), axis=0)

sns.heatmap(data=z1, cmap="coolwarm", xticklabels=False)
plt.savefig('heatmap_plot', bbox_inches='tight')
plt.show()


p = -np.log10(p)
ax = sns.scatterplot(x="log2FC", y=p,
                     hue='label',
                     hue_order=('-1', '0', '1'),
                     palette=("#377EB8","grey","#E41A1C"),
                     data=result)
ax.set_ylabel('-log(pvalue)', fontweight='bold')
ax.set_xlabel('FoldChange', fontweight='bold')

plt.savefig('deg_p_fc_plot', bbox_inches='tight')
plt.show()
数据处理 data import 可视化 数据

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