【生物信息学】scRNA-seq数据分析（一）：质控~细胞筛选~高表达基因筛选

2024-07-30 08:41:53 浏览数 (1)

一、实验介绍

  在AI for Science（AI4S）时代，我们可以利用机器学习技术来分析单细胞转录组数据，揭示细胞状态、功能和动态变化，通常可分为三个阶段：

  • 数据预处理
    • 原始数据处理及质量控制；
  • 基础分析
    • 适用于几乎所有scRNA-seq数据的基本数据分析： 数据标准化和整合、高表达基因筛选（特征选择）、降维、细胞聚类、细胞类型标注等；
  • 高级分析
    • 针对特定研究场景定制的高级数据分析： GO/KEGG富集分析、基因集变异分析、转录因子识别、轨迹推断、细胞间通讯分析、空间转录组学等。

二、实验环境

1. 配置虚拟环境

  可使用如下指令：

代码语言：javascript复制
conda create -n bio python==3.9
代码语言：javascript复制
conda activate bio
代码语言：javascript复制
pip install -r requirements.txt

  其中，requirements.txt：

代码语言：javascript复制
numpy==1.21.5
pandas==1.4.4
scanpy==1.9.6

2. 库版本介绍

软件包

本实验版本

numpy

1.21.5

pandas

1.4.4

python

3.8.16

scanpy

1.9.6

scipy

1.10.1

seaborn

0.12.2

三、实验内容

0. 导入必要的库

代码语言：javascript复制
import numpy as np
import pandas as pd
import scanpy as sc
  • Scanpy是一个用于单细胞RNA测序数据分析的Python库，提供了许多功能和工具来处理和分析单细胞数据

1. 质控与细胞筛选

设置Scanpy参数:

代码语言：javascript复制
sc.settings.verbosity = 3
sc.logging.print_header()
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white')
  • sc.settings.verbosity: 设置日志的详细程度。
  • sc.logging.print_header(): 打印日志信息的标题。
  • sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white'): 设置图形参数以进行绘图。

定义结果文件路径:

代码语言：javascript复制
results_file = 'write/pbmc3k.h5ad'
  • 定义以H5AD格式存储结果的文件路径。

读取单细胞数据:

代码语言：javascript复制
adata = sc.read_10x_mtx(
    'data/filtered_gene_bc_matrices/hg19/',  # 数据目录
    var_names='gene_symbols',                # 使用基因符号作为变量名
    cache=True)                              # 将数据写入缓存以便更快读取
  • 从10x Genomics格式读取单细胞RNA-seq数据。
  • 从指定目录读取数据，将基因符号用作变量名。
  • 将数据缓存以便将来更快地访问。

确保基因名唯一:

代码语言：javascript复制
adata.var_names_make_unique()
  • 确保数据集中的基因名是唯一的。

绘制高度表达的基因:

代码语言：javascript复制
sc.pl.highest_expr_genes(adata, n_top=20)
  • 绘制数据集中最高表达的前20个基因。
过滤细胞和基因
代码语言：javascript复制
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)
  • 过滤掉表达基因数低于200的细胞；
  • 过滤掉在至少3个细胞中表达的基因。
标记线粒体基因
代码语言：javascript复制
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')
  • 通过创建一个名为 'mt' 的变量，标记所有线粒体基因。
计算质量控制指标
代码语言：javascript复制
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], percent_top=None, log1p=False, inplace=True)
  • 计算质量控制指标，包括线粒体基因的百分比以及细胞的总基因数和总计数。
绘制质量控制指标的小提琴图和散点图
代码语言：javascript复制
sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts', 'total_counts', 'pct_counts_mt'], jitter=0.4, multi_panel=True)
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='pct_counts_mt')
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='n_genes_by_counts')
  • 使用小提琴图绘制细胞的总基因数 (n_genes_by_counts)、总计数 (total_counts) 和线粒体基因的百分比 (pct_counts_mt)。
  • 使用散点图绘制总计数与线粒体基因的百分比之间的关系，以及总计数与细胞的总基因数之间的关系。
代码整合
代码语言：javascript复制
# 设置Scanpy参数
sc.settings.verbosity = 3
sc.logging.print_header()
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white')

# 定义结果文件路径
results_file = 'write/pbmc3k.h5ad'

# 读取单细胞数据
adata = sc.read_10x_mtx(
    'data/filtered_gene_bc_matrices/hg19/',  # 数据目录
    var_names='gene_symbols',                # 使用基因符号作为变量名
    cache=True)                              # 写入缓存文件以便后续更快读取

# 确保基因名唯一
adata.var_names_make_unique()

# 绘制展示高度表达的基因
sc.pl.highest_expr_genes(adata, n_top=20)
代码语言：javascript复制
# 过滤细胞和基因
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)

# 标记线粒体基因
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')

# 计算质量控制指标
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], percent_top=None, log1p=False, inplace=True)

# 绘制质量控制指标的小提琴图和散点图
sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts', 'total_counts', 'pct_counts_mt'], jitter=0.4, multi_panel=True)
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='pct_counts_mt')
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='n_genes_by_counts')

2. 高表达基因筛选

细胞和基因进一步过滤
代码语言：javascript复制
adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts < 2500, :]
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]
  • 进一步过滤掉表达基因数超过2500的细胞和线粒体基因的百分比超过5%的细胞。
总计数归一化
代码语言：javascript复制
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
  • 对细胞进行总计数归一化，使它们的总计数总和为1e4。
对数变换
代码语言：javascript复制
sc.pp.log1p(adata)
  • 对数据进行对数变换，这通常用于使数据更加符合正态分布。
特征选择：识别高度变异的基因
代码语言：javascript复制
sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)
  • 识别高度变异的基因，以进行后续的分析。
绘制高度变异基因的图
代码语言：javascript复制
sc.pl.highly_variable_genes(adata)
  • 绘制高度变异基因的图，可视化这些基因的特性。
设置.raw属性
代码语言：javascript复制
adata.raw = adata
  • 将原始数据保存在.raw属性中，以备后续使用。
实际过滤数据
代码语言：javascript复制
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]
  • 根据高度变异的基因过滤数据，仅保留这些基因的表达数据。
数据回归处理和标准化:
代码语言：javascript复制
sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts', 'pct_counts_mt'])
sc.pp.scale(adata, max_value=10)
  • 使用线性回归回归掉总计数和线粒体基因的百分比的影响。
  • 进行数据标准化，确保每个特征的均值为0，标准差为1，并限制值的范围在0到10之间。
代码整合
代码语言：javascript复制
# 进一步的过滤和归一化
adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts < 2500, :]
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]

# 总计数归一化
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)

# 对数变换
sc.pp.log1p(adata)

# 特征选择：识别高度变异的基因
sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)

# 绘制高度变异基因的图
sc.pl.highly_variable_genes(adata)

# 设置.raw属性
adata.raw = adata

# 实际过滤数据
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]

# 数据回归处理和标准化
sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts', 'pct_counts_mt'])
sc.pp.scale(adata, max_value=10)
var 日志 数据 缓存 数据分析

0 人点赞