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今天为大家介绍的是来自华中农业大学的王旭团队的一篇论文。由于缺乏有效对抗抗生素耐药细菌的新药，全球公共卫生问题日益严重。基于本研究，作者通过结构基础药物设计（SBDD）和模块合成开发了一种改良的抗菌药物。确定了最优改良化合物F8，它在体外和体内均显示出对抗耐药细菌的广谱抗菌活性，并有效减缓了耐药性的产生。F8对耐甲氧西林、耐多粘菌素B、耐氟苯尼考（FLO）、耐多西环素、耐氨苄青霉素和耐磺胺甲恶唑的细菌表现出显著的杀菌活性。在耐药菌血症的小鼠模型中，F8被发现能够提高存活率并显著减少感染小鼠体内的细菌负荷。多组学分析（转录组学、蛋白质组学和代谢组学）表明，鸟氨酸氨甲酰基转移酶（arcB）是F8的一个抗菌靶点。进一步的分子对接、等温滴定量热法（ITC）和差示扫描荧光法（DSF）研究验证了arcB是F8的有效靶点。最后，机制研究表明，F8通过竞争性结合arcB，破坏细菌细胞膜并引起一定程度的氧化损伤。在此，作者报告F8作为开发抗生素制剂以对抗耐药细菌相关感染的有前途的候选药物。
耐药病原体，特别是超级细菌的迅速增加，对公共卫生构成了重大威胁。抗生素的发现和临床应用无疑是人类和现代医学史上的一个里程碑。它们推动了各种医疗实践的发展，是不可或缺的救命武器；然而，耐药细菌的出现和传播引发了全球传染病危机的担忧。在美国，每年有超过280万例抗生素耐药感染，导致超过35,000人死亡。在欧洲，抗生素耐药性每年导致约33,000人死亡，估计医院费用超过9亿欧元。应对这一问题的任何计划都依赖于发现对现代细菌病原体有效的新抗生素，这使得开发具有独特机制的抗生素变得至关重要。然而，开发抗生素在当今仍然具有挑战性，导致新抗生素的临床引入极为稀少。因此，迫切需要识别新的靶点和药物，以填补抗生素发现和开发的空白，并对抗细菌感染。
基于核糖体的结构基础药物设计遇到了显著的挑战，包括低分辨率的结构数据和缺乏有效处理大RNA结合位点的计算工具。早期的核糖体结构研究提供的细节有限，难以准确模拟药物相互作用并预测结合亲和力。在解析核糖体亚基及其与已知抗生素的复合物结构之前，新型抗菌剂的计算设计主要集中在配体上。这些问题一度阻碍了氯霉素类药物的研究进展。然而，现代结构技术的进步和新计算方法的发展，现在使得基于结构的药物设计成为可能，从而极大地振兴了这一研究领域。此外，与组合疗法相比，SBDD更好地解决了生物利用度、药代动力学和代谢的差异问题，带来了更高的治疗安全性并避免了药物间相互作用。
广谱抗菌小分子化合物的设计和合成
为了找到具有有效抗菌活性且不易产生耐药性的化合物，作者努力使用计算机辅助药物设计（CADD）设计并合成广谱抗菌小分子化合物。在SBDD和模块合成的指导下，作者选择了结构简单、分子量低且易于合成的FLO作为主要骨架结构。以细菌50S核糖体亚基的肽酰转移酶中心（PTC）为靶点，作者应用CADD并开发了一条模块化合成路线。通过形成酯键连接这些成分，作者生产了各种抗菌候选药物。因此，作者研究了广泛的结构变化并评估了它们的抗菌活性。
图 1
首先，作者使用蛋白质数据银行（PDB: 6c4h）的50S亚基PTC区域的晶体结构进行分子对接研究。然后，作者对50S亚基PTC区域的结合口袋进行了建模，并建立了反映空间中各点原子属性偏好的原子属性场（图1a）。FLO的结构-活性关系表明，其主要骨架占据了50S亚基PTC区域的保守区域，因此作者选择保持该区域静止，并对β-羟基位置进行结构修饰。羟基为小分子的合成提供了很大的优势。即使是新生成的化合物，也必须符合易于合成的机制，否则它们的广泛影响将是最小的。
接下来，作者选择了各种简单的小分子结构，包括三环、四环、五环和六环结构，通过ChemDraw软件与骨架结构连接生成了数百种化合物结构用于自动分子对接。根据SYBYL-X的评分，一些领先化合物表现出比骨架结构更强的结合力、更低的分子间碰撞力和更紧密的受体蛋白结合（图1b）。基于对接模拟，具有较小片段的配体具有较低的崩溃值，这表明在结合口袋内具有较小空间构象的结构可以降低配体可能经历的内部自碰撞水平，从而增强结合的稳定性。崩溃值是配体与受体蛋白不正确对接的程度，接近0的崩溃评分是有利的。在这些研究中，作者综合选择了11种评分最高的化合物，这些化合物的总分和极性均高于骨架化合物，并且具有良好的结合特异性和亲和力。这些化合物然后在50S亚基的PTC区域进行了视觉比较和合成，通过LCMS-IT-TOF、1H-NMR和13C-NMR测量确认了结构（图1c）。
F8是一种候选抗生素
F8的化学结构如图1c所示。为了评估其体外抗菌活性，作者测定了F8对各种细菌的最小抑菌浓度（MIC），包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。F8对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出显著的抗菌活性，MIC值范围为2到8 μM。此外，作者使用代表性的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌作为模型，研究了F8的抗菌活性和作用机制。
为了确认其生物活性，作者采用琼脂扩散法测试了F8对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。作者观察到F8持续抑制了病原体的生长，显示出明显的抑制区。进一步评估了F8对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长抑制效果，生长曲线显示F8在4×MIC、2×MIC和MIC浓度下有效抑制了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，特别是在半MIC浓度下显著抑制了金黄色葡萄球菌的生长。基于最小杀菌浓度（MBC）和MIC值，作者确认F8是一种有效的候选抗菌剂。
图 2
为了进一步评估F8的体内治疗潜力，作者使用通过腹腔注射金黄色葡萄球菌诱导的小鼠脓毒症模型来测试F8对细菌感染的治疗效果。细菌菌落计数显示，60 mg/kg的F8可以有效减少肝脏、脾脏、肾脏和血液中的细菌负荷（图2a–d）。感染金黄色葡萄球菌的小鼠肾脏组织（皮质和髓质）表现出广泛的管状坏死，结构不清晰（图2e）。肾小管内的炎症细胞浸润以粒细胞为中心，并伴有坏死和炎症细胞聚集，显著的肾小管扩张和局灶性出血在感染组也很显著。肝细胞表现出空泡变性和炎症细胞浸润，血管内可见出血。脾脏的红髓和白髓边界不清晰，红髓中的中性粒细胞和巨噬细胞数量增加。然而，在F8治疗组几乎没有观察到显著的病理变化。
图 3
为了进一步证明F8作为抗菌剂的潜力，作者还研究了F8对器官损伤的影响。结果显示，在1500 mg/kg的F8治疗组中，肝脏、肾脏和肠道未观察到显著的异常，脾脏、肾脏和骨髓也未观察到显著的病理变化（图3a, b, i）；然而，阳性对照FLO组的肝细胞表现出轻微的空泡变性和炎症细胞浸润，血管内可见轻微出血。脾脏的红髓和白髓边界不清晰，红髓中的中性粒细胞和巨噬细胞数量增加（图3i）。酶联免疫吸附试验（ELISA）结果显示，F8治疗组和对照组之间的血液中IL-6水平无显著差异，但IL-2和Hsp70水平存在显著差异（图3c–e）。作为一种高度保守的应激蛋白，Hsp70在暴露于有害刺激或应激因子时表达水平显著增加，在免疫调节中起着关键作用。与对照组相比，F8组胸腺和脾脏中Hsp70的浓度无显著差异，但在骨髓中显著增加（图3f–h）。在TUNEL染色分析中，与阳性对照FLO相比，F8处理的免疫器官（胸腺、脾脏和骨髓）未显示出强烈的荧光，表明细胞死亡较少（图3j）。
此外，在小鼠14天急性毒性研究中，F8表现出耐受性。在最高剂量5000 mg/kg下，未观察到异常临床症状（图3k）。F8对哺乳动物细胞的细胞毒性也较低（图3l–n）。此外，作者发现F8对绵羊红细胞的溶血率较低，即使在256 μM浓度下也几乎没有溶血（图3o）。
F8克服了耐药性并在体内有效
图 4
细菌耐药性也是抗菌药物潜在临床应用的重要指标。为了评估F8的耐药性发展，作者进行了体外研究，连续30天将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌暴露于F8的亚抑制浓度。与阳性对照FLO相比，细菌对F8发展的耐药趋势较低（图4a, b）。随后，测试了F8对诱导的FLO耐药金黄色葡萄球菌和FLO耐药大肠杆菌的抑制效果，结果发现F8显著增强了对这些FLO耐药细菌的抑制效果（图4c）。这些结果表明F8在避免细菌耐药性方面具有更大的优势。
为了进一步评估F8的体内抗菌作用，作者建立了一个FLO耐药金黄色葡萄球菌的小鼠脓毒症模型。令人兴奋的是，生存曲线显示，在感染耐药细菌的小鼠中，F8治疗组在72小时内的存活率高达50%，而在相同条件下，阳性对照FLO的存活率在48小时内降至0（图4i）。这种生存分析表明，F8治疗组能够显著抑制体内的耐药细菌，并具有显著的生存优势。
随后对细菌负荷测量的评估与生存率分析一致。在F8治疗24小时后，肝脏、脾脏、肾脏和血液中的细菌负荷显著减少（图4d–g），此外，F8对FLO耐药金黄色葡萄球菌的入侵表现出显著的抑制效果。此外，组织病理学检查显示FLO耐药金黄色葡萄球菌组中明显的组织坏死和损伤，而F8治疗显著缓解了细菌感染引起的肝脏、肾脏和脾脏组织的坏死和损伤（图4h）。结果表明，F8有效减轻了FLO耐药金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
从多组学分析中发现arcB是F8的抗菌靶点
图 5
为了揭示F8在其抗金黄色葡萄球菌活性中的潜在靶点，作者使用转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析了F8处理后的细菌变化（图5a）。转录组分析显示，在F8处理前后，共有1212个差异表达基因（DEGs）（598个上调和614个下调）显示出显著的表达模式。
基于多组学分析，在所有三组学数据集中都观察到了氮代谢和精氨酸生物合成的下调，因此作者推测F8对抗金黄色葡萄球菌的一个重要抗菌靶点可能涉及精氨酸降解代谢途径。在精氨酸降解代谢途径中，精氨酸脱亚氨酶（arcA）、arcB和氨基甲酸激酶（arcC）被分类为精氨酸脱亚氨酶途径（ADI）。如图5b所示，RT-PCR结果与转录组数据一致。值得注意的是，由于arcB参与精氨酸降解，也是精氨酸生物合成不可或缺的一部分，研究表明arcB水平可能限制金黄色葡萄球菌精氨酸的生物合成。因此，作者初步推断arcB是F8的一个可能靶点。
F8与arcB的结合
鉴于F8在多组学分析中显著影响了arcB的表达，作者认为F8通过靶向arcB蛋白并影响其功能来发挥抗菌活性。为了进一步详细描述F8和arcB的结合模式，作者在PDB数据库中搜索了arcB蛋白的晶体结构（PDB: 2ksd），并使用SYBYL-X软件进行了分子对接研究。作者发现F8能够与arcB蛋白结合并占据其结合口袋（图5c, d），F8的环状结构嵌入受体蛋白的腔体中，增强了结合的紧密度。如图5c所示，F8通过与arcB的LEU-31氢键相互作用直接与arcB结合。
为了进一步验证F8可以直接与arcB结合，作者表达了arcB蛋白并检查了它们的相互作用（图5e）。等温滴定量热法（ITC）测量进一步证实了F8与arcB活性口袋之间的预测相互作用。结果显示，F8能够直接且特异性地与arcB蛋白结合（Kd = 1.081 ± e−5 M）（图5f）。随后，作者采用差示扫描荧光法（DSF）评估化合物结合引起的蛋白质热稳定性变化以验证相互作用。与空白对照相比，arcB蛋白与F8共同孵育时观察到热转变（ΔTm变化）（图5h），提供了F8与arcB蛋白结合的证据。这些结果共同表明，F8可以在体外高亲和力地直接结合arcB。
为了进一步确认arcB是F8活性增加的重要因素，作者选择了三株具有固有cfr耐药性的细菌进行MIC实验。结果显示，在这些具有cfr耐药性的菌株中，F8仍保持显著活性，MIC值为16-32 µM，而FLO的活性显著降低，MIC值> 128 µM（图5i）。这表明F8的抗菌机制不仅仅依赖于核糖体抑制，arcB在F8的抗菌活性中是一个重要靶点。此外，作者检查了F8对arcB缺失突变株的抗菌活性。结果显示，在ΔarcB突变株多杀巴斯德菌中，F8的抗菌效果减弱，MIC为16 µM，而FLO的MIC未改变，仍为8 µM（图5j），进一步表明arcB是F8的有效靶点。
F8的杀菌机制
图 6
鉴于arcB在细胞生长和生物膜形成中的广泛调控能力，作者假设F8可能通过破坏细菌细胞膜来发挥其抗菌作用。为此，作者检测了细菌的细胞外内容物，发现F8处理后，不同浓度（4×MIC、2×MIC和MIC）在不同时间间隔内DNA、RNA和蛋白质的浓度呈现上升趋势（图6a, b）。这种现象的原因可能是F8可以改变细菌细胞膜的通透性，导致这些物质的外排增加。或者，F8可能对细菌细胞膜结构具有破坏作用，导致细菌内容物直接外排。无论是哪种原因，细菌DNA、RNA和蛋白质含量的减少都会破坏其正常的生理活动，导致抑菌或杀菌效果。通过PI染色进一步检查细菌细胞膜通透性，结果显示F8在金黄色葡萄球菌中诱导了膜通透性的增加（图6c, d）。这表明F8可以改变细菌细胞膜的通透性或破坏细胞膜结构，进而发挥抑菌或杀菌效果。
与此一致的是，膜刚度的变化破坏了细菌的稳态，导致基本的代谢混乱，包括质子动力势（PMF）的消散。因此，作者使用荧光探针BCECF-AM评估了金黄色葡萄球菌中的ΔpH，这是PMF的关键组成部分。实验通过用4×MIC的F8处理细菌进行。结果显示，在药物添加后1小时内，ΔpH显著消散（图6e, f），这与杀菌效果一致。这可能表明细菌膜刚度的变化破坏了细菌的稳态，导致基本的代谢混乱，并导致质子动力势的消散。
另一方面，膜稳态的破坏通常会导致活性氧（ROS）的积累。此外，先前的研究表明，在大肠杆菌中删除arcB会导致在有氧条件下对过氧化氢的敏感性增加。研究显示F8增加了细胞内的ROS含量（图6g, h），这可能会相应地加剧膜损伤并进一步破坏细菌的稳态。内源性ROS在杀菌活性中起着关键作用。F8预计通过多种方式刺激ROS的产生，同时抑制arcB的活性，导致抗氧化能力的下降。这种双重作用可能导致更严重的氧化损伤，从而实现更好的杀菌效果，并可能避免单一因素导致的耐药性效果。有趣的是，作者观察到F8处理后ATP水平呈剂量依赖性增加（图6i, j）。这种结果与先前的研究一致，表明杀菌性抗生素与加速呼吸有关。这些发现为F8破坏细菌细胞膜并诱导一定程度的氧化损伤的观点提供了有力的表型支持。
讨论
抗菌药物耐药性已演变为全球健康危机。尽管抗生素在对抗细菌方面不可或缺，但其过度使用导致耐药细菌尤其是超级细菌的迅速增加，迫切需要开发新策略来治疗细菌感染。基于结构基础药物设计和模块合成，作者确定了F8为最优改良化合物，对多种致病菌显示出显著的抗菌活性，特别是对耐药性极强的病原体如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐多粘菌素B的细菌表现出抑制效果。F8通过多组学分析影响多个代谢途径，如氮代谢、精氨酸生物合成等，并通过竞争性结合arcB蛋白，改变细菌细胞膜通透性或破坏细胞膜结构，增加细胞内活性氧含量，从而发挥杀菌效果。作者的研究表明，F8是一种有前途的候选药物，可用于开发对抗耐药细菌感染的抗生素制剂。
编译 | 于洲
审稿 | 曾全晨
参考资料
Feng J, Zheng Y, Ma W, et al. A synthetic antibiotic class with a deeply-optimized design for overcoming bacterial resistance[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 6040.
