第一代测序技术
Whitfeld——多聚核糖核苷酸链的降解法
- 利用磷酸单酯酶的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化作用从链末端逐一分离寡核糖核苷酸并测定其种类
- 一个一个“数”——得到DNA序列
Sanger——“双脱氧终止反应法”，他就是利用了双脱氧核苷酸 ddNTP去摸索DNA分子
- 双脱氧核苷酸（ddNTPs）——在2、3号位碳上都脱氧，核糖之间的连接——磷酸二酯键需要3号位碳上羟基提供氢，双脱氧核苷酸没有这个羟基，所以聚合反应将无法从5'端向3'继续延伸，聚合反应终止。
dNTPs与ddNTPs相同点
- 具有不同结构和功能的核苷酸
- 糖、含氮碱基和磷酸基团是核苷酸的三个组成部分。 核苷酸形成磷酸二酯键以形成DNA
ddNTPs与ddNTPs区别
- dNTPs是指脱氧核糖核苷酸三磷酸，每个dNTP由一个磷酸基团、脱氧核糖和一个含氮碱基组成，而ddNTPs是指双脱氧核苷酸三磷酸
- dNTPs 是 DNA 的组成部分，而 ddNTPs 是 Sanger 测序方法中使用的核苷酸
- dNTP 在脱氧核糖中含有 3' OH 基团，而 ddNTP 在双脱氧核糖中不含 3' OH 基团
- dNTPs 可以形成磷酸二酯键，而 ddNTPs 不能形成磷酸二酯键
- dNTPs 在 DNA 合成中很重要，而 ddNTPs 在 Sanger 测序方法的链终止反应中很重要。
- 读长长，准确度高，通量低
二代测序-循环阵列合成测序法
专业名词
- flowcell(流动池）： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
- lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
- tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
- 双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
- junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
- flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
主要平台
- 罗氏454公司的GS FLX sequencer
- Illumina solexa genome analyzer——主流（边合成边测序）
- ABI公司的SOLiD sequencer
原理
- 用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息
构建文库
- 超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段，用酶补平为平末端，然后3'端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter（接头），再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。
簇的生成——桥式PCR
- Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。（互补杂交）DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
- 桥式PCR——PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍
测序
- 带荧光的dNTP
- 酶
- 扫描
数据产出
优缺点
- 提高测序速度，降低测序成本，保持高准确性
- 读长短，拼接困难，pcr技术增加了测序的错误率
三代测序
- PacBio 实时单分子测序
- Complete Genomics公司的复合探针-锚定连接技术
- Complete Genomics公司的复合探针-锚定连接技术
- Ion Torrent电子流检测技术
优缺点
- 无需PCR扩增，超长读长
- 对每一条DNA分子单独测序
- 错误率高
- 无视GC含量影响
