文章概述
文章标题：《Resolving the difference between left-sided and right-sided colorectal cancer by single-cell sequencing》
发表日期和杂志：2021年发表在JCI INSIGHT上
在线阅读链接：https://doi.org/10.1172/jci.insight.152616
实验设计
结直肠癌(CRC)的发病率、发病机制、分子途径和转归因肿瘤部位而异。右侧结直肠癌(CRC；起源于盲肠、升结肠、肝曲)和左侧结直肠癌(起源于脾弯、降结肠、乙状结肠)通常被归为一种疾病，它们的预后和治疗结果有显著差异。
对3例左侧和3例右侧结直肠癌根治性手术中获得的6个样本中的27,927个细胞进行了scRNA-Seq检测，并构建了恶性结直肠癌的单细胞转录组图谱。
单细胞转录组数据情况
数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE188711
文章选择3例左侧和3例右侧患者的27,927个单个人结直肠癌细胞进行综合分析，一共是6个样品。
代码语言：javascript复制GSM5688706 Left-sided CRC 1
GSM5688707 Left-sided CRC 2
GSM5688708 Left-sided CRC 3
GSM5688709 Right-sided CRC 1
GSM5688710 Right-sided CRC 2
GSM5688711 Right-sided CRC 3
提供了10X格式的三个文件，使用Read10X函数读取即可。
代码语言：javascript复制GSM5688706_barcodes_WGC.tsv.gz 23.3 Kb
GSM5688706_features_WGC.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688706_matrix_WGC.mtx.gz 20.3 Mb
GSM5688707_barcodes_JCA.tsv.gz 22.2 Kb
GSM5688707_features_JCA.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688707_matrix_JCA.mtx.gz 25.8 Mb
GSM5688708_barcodes_LS-CRC3.tsv.gz 29.6 Kb
GSM5688708_features_LS-CRC3.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688708_matrix_LS-CRC3.mtx.gz 27.8 Mb
GSM5688709_barcodes_RS-CRC1.tsv.gz 28.4 Kb
GSM5688709_features_RS-CRC1.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688709_matrix_RS-CRC1.mtx.gz 28.0 Mb
GSM5688710_barcodes_R_CRC3.tsv.gz 21.0 Kb
GSM5688710_features_R_CRC3.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688710_matrix_R_CRC3.mtx.gz 17.3 Mb
GSM5688711_barcodes_R_CRC4.tsv.gz 30.0 Kb
GSM5688711_features_R_CRC4.tsv.gz 274.6 Kb
GSM5688711_matrix_R_CRC4.mtx.gz 27.3 Mb
数据下载导入，并创建Seurat对象：
代码语言：javascript复制###### step1:导入数据 ######
library(data.table)
dir='GSE188711_RAW/outputs/'
samples=list.files( dir )
samples
library(data.table)
sceList = lapply(samples,function(pro){
# pro=samples[1]
print(pro)
sce=CreateSeuratObject( Read10X(file.path(dir,pro)),
project = pro,
min.cells = 5,
min.features = 300 )
return(sce)
})
names(sceList)
samples
sce.all=merge(x=sceList[[1]],
y=sceList[ -1 ],
add.cell.ids = samples)
as.data.frame(sce.all@assays$RNA@counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all$orig.ident)
在批量读取数据之前，一般要先读取一个数据用来进行测试，确认无误后，再使用循环批量读取全部的数据用于后续的分析。
后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及细分亚群定义等。
第一层次降维聚类分群
对27,927个高质量细胞使用t-SNE进行可视化，基于已知标记基因的表达来可视化细胞类型集群。
发现几个细胞团在左侧和右侧的结直肠癌中都得到了丰富，共有13,488个单细胞起源于左侧CRC，而14,439个单个细胞起源于右侧CRC。
通过平均基因特征的无监督层次聚类，显示细胞簇的关联性(相关距离度量、平均连锁)
使用小提琴曲线图展示了已知标记基因在结直肠癌不同细胞类型中的表达分布。
其它加分项
左侧和右侧结直肠癌细胞特异性表达的变化
将DEG的数目投影到t-SNE图上显示，发现第4簇癌细胞在结直肠癌的TME中表现出最显著的转录变化，这表明肿瘤细胞群在左侧和右侧的结直肠癌之间存在最本质的转录差异。
【右侧主要细胞亚群】
对T细胞亚群进行研究，发现初始CD4 T细胞在右侧结直肠癌中占主导地位，并且右侧结直肠癌占据了高度迁移的耗尽CD8 T细胞的很大比例。
CD4 T细胞分布
CD8 T细胞分布
【左侧主要细胞亚群】
分析发现，来自左侧结直肠癌的treg表现出更高水平的免疫治疗相关基因，并且RBP4 NTS 癌细胞亚群是左侧结直肠癌所特有的。
Treg通过分泌可溶性免疫抑制因子和表达抑制性受体来抑制效应T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能。在各种类型的人类癌症中，肿瘤浸润性T细胞中Tregs的高比例与预后不良有关。
根据t-SNE分析将结直肠癌细胞进一步划分为9个亚群
免疫组织化学证实，AGR2、AGR3、TFF1、TFF2、MUC5AC和SPINK4在左侧大肠癌中的表达水平高于右侧。
文章小结：
- 右侧结直肠癌中有相当大比例耗尽的CD8 T细胞具有高度迁移性。左侧结直肠癌的一簇细胞在衰竭前呈现状态，且预衰竭/衰竭T细胞比率高是有利的预后标志。
- 确定了一种潜在的新的RBP4 NTS 癌细胞亚群，该亚群仅在左侧结直肠癌中扩张。左侧结直肠癌的Tregs显示免疫治疗相关基因水平高于右侧结直肠癌，这表明左侧结直肠癌可能对免疫治疗有更高的反应性。
- M2类巨噬细胞诱导的抗体依赖性细胞吞噬功能(ADCP)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)在左侧结直肠癌中更为明显，且与结直肠癌的良好预后相关。
